免疫组化操作步骤
免疫组化操作规程
一仪器设备
118cm不锈钢高压锅和电炉2医用微波炉3水浴箱; 4冰箱-18-45湿盒6耐高温塑料切片架7可调微量移液器8定时器9pH计
二试剂
1PBS(磷酸盐缓冲液pH7.27.4)NaCl 137mmol/LKCl 2.7mmol/LNa2HPO4 4.3mmol/LKH2PO4 1.4mmol/L
2柠檬酸盐缓冲液CBpH6.00.01mol/L1000ml配制柠檬酸三钠 3g柠檬酸 0.4g
3酶消化液 a0.1%胰蛋白酶液用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制 b0.4%胃蛋白酶液用0.1N的HCl配制
三操作流程
1 脱蜡和水化
脱蜡前将组织芯片放在60恒温箱中烘烤30分钟
1置于二甲苯I中浸泡10分钟在二甲苯II中再浸泡10分钟
2无水乙醇I中浸泡5分钟在无水乙醇II中再浸泡5分钟
395%乙醇中浸泡5分钟
485%乙醇中浸泡5分钟
570%乙醇中浸泡5分钟
6蒸馏水中浸泡5分钟
2抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片
1抗原热修复
A 高温高压热修复 取一定量的0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0于压力锅中大火加热至沸腾将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上放入已沸腾的缓冲液中盖上锅盖扣上压力阀继续加热至喷气从喷气开始计时1-2分钟后压力锅离开热源冷却至室温取出玻片先用蒸馏水洗两次后用PBS洗5分钟
B微波热修复取一定量的0.01M柠檬酸盐缓冲液pH6.0于微波盒中微波加热至沸腾将脱蜡水化后的组织芯片置于耐高温塑料切片架上放入已沸腾的缓冲液中中高档继续处理10-15分钟取出微波盒冷却至室温取出玻片先用蒸馏水洗两次后用PBS洗5分钟
C酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液胰蛋白酶使用前预热至37切片也预热至37消化时间约为5~30分钟胃蛋白酶消化37时间为10-30分钟
3免疫组织化学染色
SP法
1脱蜡水化
2蒸馏水中5分钟
3用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2室温封闭10分钟蒸馏水洗1次
4抗原修复
5PBS洗5分钟
6滴加正常山羊血清封闭液,室温10分钟
7甩去多余液体滴加抗371小时或者4过夜4过夜后在37复温45分钟
8PBS洗2次各5分钟
9滴加生物素化抗孵育条件参见所用试剂盒
10PBS洗2次各5分钟
11滴加酶标抗体孵育条件参见所用试剂盒
12PBS洗2次各5分钟
13DAB显色510分钟在显微镜下掌握染色程度
14蒸馏水洗终止染色苏木素复染盐酸酒精分化
15脱水透明封片镜检
SABC法
1脱蜡水化
2蒸馏水中5分钟
3用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2室温封闭510分钟蒸馏水洗1次
4抗原修复
5PBS洗5分钟
6滴加正常山羊血清封闭液室温10-20分钟甩去多余液体
7滴加抗,371小时或者4过夜4过夜后在37复温30分钟
8PBS洗2次每次5分钟
9滴加生物素化二抗孵育条件参见所用试剂盒
10PBC洗2次每次5分钟
11滴加试剂SABC孵育条件参见所用试剂盒
12PBS洗2次每次5分钟
13DAB显色DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色镜下掌握显色程度
14蒸馏水洗终止染色苏木素复染盐酸酒精分化
15脱水透明封片镜检
试剂推荐：
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英文名 |
中文名 |
规格/价格 |
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SP Kit (Broad Spectrum). |
免疫组化检测试剂盒（通用型广谱是指;可用于检测兔、大鼠、小鼠和豚鼠来源的一抗） |
3ml/220 6ml/380 18ml/1070 |
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SP Kit (Rabbit) |
免疫组化检测试剂盒(兔) |
3ml/220 6ml/380 18ml/1070 |
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SP Kit (Mouse) |
免疫组化检测试剂盒(小鼠) |
3ml/220 6ml/380 18ml/1070 |
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Double Staining Kit (Mo/HRP+Rb/AP) |
免疫组化双染检测试剂盒(鼠/兔一抗) |
6ml/1860 |
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DAB kit |
二氨基联苯胺/DAB染色试剂盒（25倍稀释） |
1ml/90 |
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DAPI |
DAPI染色液(细胞核染色液) |
10ml/90 30ml/220 |
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Goat serum |
封闭用正常山羊血清（原液） |
5ml/25 10ml/40 |
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Rabbit serum |
封闭用正常兔血清（原液） |
5ml/25 10ml/45 |
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mouse serum |
封闭用正常小鼠血清（原液） |
5ml/35 |
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IHC Antibody Diluent |
免疫组化抗体稀释液 |
100ml/120 |
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DAB |
DAB显色剂（SIGMA分装） |
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Trypsin Induced Antigen Retrieval Solution |
胰蛋白酶抗原修复液 |
3ml/180 10ml/348 |
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胰蛋白酶抗原修复液（含使用方法说明） |
10ml/348 |
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Citrate buffer( |
柠檬酸盐缓冲液（ |
1000ml/袋/4 2000ml/袋/8 |
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Citrate buffer( |
抗原热修复试剂(100×浓缩液) |
70ml/90 |
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Poly-L-Lysine Solution(10×) |
多聚赖氨酸(10×防脱片剂) |
5ml/110 10ml/200 100ml/1600 |
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Poly-L-Lysine |
多聚赖氨酸(防脱片剂) |
25mg/460 50mg/750 100mg/1300 |
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poly-L-lysine-Prep Slides |
多聚赖氨酸防脱磨砂玻片 |
50片/100 |
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Glass slides |
载玻片 |
50片/40 |
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防脱片液(硫酸铬钾-明胶黏片剂粉剂) |
200ml/50 500ml/100 |
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HE Staining Kit |
苏木素-伊红染色试剂盒 |
50ml/500片/180 |
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APES |
APES防脱片试剂 |
10ml/85 |
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Citrate buffer powders( |
柠檬酸盐缓冲液(抗原热修复试剂)（ |
1000ml/pouch/4 |
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Citrate buffer( |
柠檬酸盐缓冲液 （ |
500ml/袋/200 |
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Permount TM Mounting Medium |
中性树胶封片剂 |
100ml/150 |
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PBS, powder, ( |
磷酸盐缓冲液( |
1000ml/pouch/4 2000ml/pouch/8 |
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Triton X-100 |
聚乙二醇辛基苯基醚 |
100ml/40 |
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Tris |
三羟甲基氨基甲烷 |
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Tween 20 |
吐温20 |
100ml/40 |
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